Teknologi diagnostik molekul hari ini berkembang pada kadar yang belum pernah terjadi sebelumnya, dengan kemajuan yang ketara dalam tempoh dua tahun yang lalu. Antaranya, teknologi penguatan isoterma telah mendapat lebih banyak perhatian kerana keupayaan mereka untuk melakukan penguatan tanpa memerlukan peralatan khusus. Beberapa kaedah penguatan isoterma yang terkenal wujud, seperti Lamp, RPA, dan RAA. Walau bagaimanapun, hari ini saya ingin memperkenalkan teknologi penguatan isoterma yang lebih baru.
Untuk memastikan semua orang mempunyai pemahaman yang konsisten tentang konsep utama, berikut adalah beberapa penjelasan istilah:
- Penguatan polimerase rekombinase (RPA): Ini adalah teknologi penguatan rekombinase-mediated.
-Penguatan bantuan rekombinase (RAA): kaedah penguatan rekombinase yang sama.
- Penguatan isoterma yang dimediasi gelung (LAMP): Satu lagi teknik penguatan isoterma.
- Multienzyme Isothermal Rapid Amplification (MIRA): Teknologi Penguatan Rapid Isoterma Baru.
Ringkasan dan penjelasan cepat:
Ramai yang mungkin tertanya -tanya dari mana -mana kaedah penguatan isoterma ini lebih dipercayai dan stabil. Pada hakikatnya, setiap teknologi mempunyai kekuatan dan batasannya. Walau bagaimanapun, faktor utama untuk penggunaan yang berjaya adalah keupayaan untuk skala pengeluaran dengan pasti, kos rendah, dan prestasi yang mantap merentasi pelbagai aplikasi.
Saya sekarang akan menganalisis setiap teknologi secara ringkas berdasarkan apa yang saya tahu:
Lampu (penguatan isoterma yang dimediasi gelung):
Ramai di lapangan tahu bahawa lampu berasal dari Jepun, yang dibangunkan oleh Dr Notomi pada tahun 2000 sebagai teknik penguatan gen baru. Pada masa ini, pemilikan teknologi ini milik syarikat Jepun Eiken Chemical Co., Ltd.
Kelebihan:
- Kepekaan tinggi (2-5 pesanan magnitud yang lebih tinggi daripada kaedah PCR tradisional).
- Masa reaksi pendek (tindak balas boleh diselesaikan dalam 30-60 minit).
- Tidak perlu instrumen khas dalam penggunaan klinikal (walaupun turbidimeter masa nyata disyorkan semasa pembangunan kit).
- Mudah untuk beroperasi (sama ada mengesan DNA atau RNA, proses melibatkan pencampuran penyelesaian tindak balas, enzim, dan templat dalam tiub tindak balas, kemudian mengeram pada kira -kira 63 darjah untuk 30-60 minit dalam mandi air atau inkubator, dengan hasil yang dapat dilihat oleh mata telanjang).
Kekurangan:
- Kepekaan yang tinggi boleh mengakibatkan pencemaran aerosol apabila tiub dibuka, menjadikannya tidak sesuai untuk digunakan di luar makmal PCR kerana risiko positif positif.
- Reka bentuk primer mencabar, menjadikannya tidak sesuai untuk beberapa penyakit, terutama yang disebabkan oleh virus dengan beberapa urutan biasa.
- Permohonannya agak terhad.
RPA dan RAA Teknologi Penguatan Isothermal:
Kedua -dua kaedah ini sebahagian besarnya homolog, dengan perbezaan utama menjadi sumber rekombinase yang digunakan.
- Rekombinase RPA berasal dari bacteriophage T4.
- Rekombinase RAA berasal dari bakteria atau kulat.
Mata utama prinsip kerja:
1. Dengan kehadiran ATP, rekombinase mengikat kepada primer, membentuk kompleks asid protein-nucleic, yang kemudian mencari DNA sasaran yang sepadan.
2. Sebaik sahaja primer mendapati templat DNA yang sepadan, ATP Hydrolysis menyediakan tenaga untuk rekombinase untuk meninggalkan primer, dan polimerase DNA mensintesis helai DNA baru.
3.
Kelebihan:
- Reaksi RPA/RAA sangat cepat, dengan hasil yang dapat dicapai dalam masa kira -kira 30 minit.
- Kepekaan boleh mencapai 10 salinan/μL.
- Tidak perlu peralatan kompleks semasa penguatan.
-Perkembangan selanjutnya kaedah kromatografi emas berasaskan siasatan atau koloid sangat memudahkan tafsiran hasil, menjadikannya sesuai untuk digunakan di kawasan yang terhad atau ekonomi yang kurang bernasib baik.
Kekurangan:
- RPA adalah teknologi yang dibangunkan oleh syarikat British TwistDX, yang kini dimiliki oleh Abbott, mengakibatkan kos yang tinggi, kitaran bekalan yang panjang, dan kekurangan sokongan teknikal. Ini menjadikan aplikasi berskala besar dan pengeluaran besar-besaran sukar di China.
- RAA adalah teknologi semata -mata domestik, tetapi ia tidak mempunyai kestabilan dari segi rintangan gangguan dan konsistensi reagen produk. Selain itu, proses pembuatan enzim berfungsi memerlukan peningkatan. Walaupun teknologi telah di pasaran selama lima tahun, ia belum lagi diterima pakai kerana masalah kestabilan dan fleksibiliti.
- Kedua -dua RPA dan RAA memerlukan primer yang panjangnya 30-35 bp. Primer yang lebih pendek mempengaruhi kekhususan, kepekaan, dan kelajuan penguatan, menjadikan reka bentuk primer mencabar.
MIRA (Multienzyme isothermal Rapid Amplification):
MIRA adalah teknologi penguatan isoterma novel yang diperkenalkan pada pertengahan -2019. Ia adalah homolog kepada RPA dan RAA.
Walaupun MIRA berkongsi persamaan dengan RPA dan RAA dari segi prinsip-prinsip kerja, terdapat perbezaan yang signifikan dalam pemilihan enzim, penanaman, pembersihan, dan lain-lain aspek pengeluaran besar-besaran. Selain itu, pasukan teknikal di belakang pemaju Mira, AmpFuture, telah menghabiskan hampir 11 tahun menyempurnakan teknologi. Ia kini dilengkapi sepenuhnya untuk menyokong pembangunan reagen siap sedia, pembangunan tersuai, projek penyelidikan, dan perkhidmatan lain yang disesuaikan.
Kelebihan:
1. Protein berfungsi dalam reagen MIRA diperoleh daripada pelbagai enzim, dengan beberapa enzim yang menjalani pengubahsuaian yang disasarkan untuk meningkatkan kecekapan sistem enzim teras, menghasilkan sistem yang lebih komprehensif.
2. Rintangan gangguan dan kestabilan yang kuat. Reagen MIRA menjalani pengoptimuman yang luas dari segi pemilihan dan kepekatan cofactor, bersama-sama dengan proses pengeluaran pembekuan, menjadikannya lebih tahan terhadap gangguan dan lebih stabil.
3. Penyesuaian dan fleksibiliti. Oleh kerana kawalan lengkap ke atas pengeluaran protein berfungsi dan pemahaman yang mendalam tentang teknologi, MIRA dapat disesuaikan dengan pelbagai aplikasi, yang menawarkan sistem reagen yang berbeza dan perkhidmatan penyesuaian yang diperibadikan.
4. Paten proprietari. Oleh kerana MIRA adalah 100% dibangunkan secara domestik, tidak ada risiko pelanggaran paten semasa pembangunan produk. Ini memberikan MIRA kelebihan daya saing di pasaran domestik dan antarabangsa.
5. Protokol pengeluaran lengkap telah ditubuhkan, membolehkan pengeluaran berskala besar yang stabil.
Kekurangan:
1. Pengiktirafan pasaran masih rendah, dan lebih banyak data dan rujukan dari bidang yang berbeza (seperti kadar positif di kawasan yang berbeza) diperlukan untuk mendapatkan penerimaan yang lebih luas.
2. Reka bentuk primer masih mengikuti ciri -ciri RPA atau RAA, yang memerlukan urutan primer atau probe yang lebih lama, yang mungkin tidak memudahkan suis cepat untuk pengguna PCR semasa.