《Pembangunan novel CAS13A/CAS12A-Mediated"Satu pot" dwi ujian pengesanan untuk tanaman yang diubahsuai secara genetik ekspres
Tanaman yang diubahsuai secara genetik telah ditanam secara meluas di seluruh dunia, dan banyak negara secara beransur -ansur meningkatkan langkah pengawalseliaan mereka untuk memastikan keselamatan tanaman yang diubahsuai secara genetik. Perkembangan kaedah pengesanan genetik yang cepat dan tepat di tapak sangat penting untuk pertanian dan biosafety, dan dapat mengurangkan kebimbangan orang ramai mengenai produk yang diubahsuai secara genetik.
Dalam kajian ini, kumpulan penyelidikan membangunkan satu reaksi satu pot baru -- MIRA dual pengesanan yang digabungkan dengan dua CRISPR (kaedah MR-DCA) untuk pengesanan serentak CAMV35S dan sasaran genetik NOS dalam tanaman yang diubahsuai secara genetik, memberikan kaedah pengesanan yang mudah dan cekap untuk pengesanan crops yang diubahsuai secara genetik.
Kaedah eksperimen
Produk dwi Mira dianalisis oleh sistem dwi Cas13A dan Cas12A untuk menghasilkan dua isyarat bebas yang tidak mengganggu satu sama lain, dan kemudian warna pendarfluor dibaca oleh instrumen pencahayaan atau dengan jalur ujian dengan dua baris T untuk mencapai pembacaan dwi-saluran. Seluruh proses selesai dalam masa kurang dari 35 minit, dengan had pengesanan serendah 20 salinan.
(Prinsip Pengesanan MR-DCA CAMV35S dan NOS)
Seluruh eksperimen dibahagikan kepada tiga langkah: MIRA amplifikasi, tindak balas CRISPR, dan dua kaedah tafsiran hasil.
Gen CAMV35S digunakan sebagai sasaran CAS13A, dan gen NOS digunakan sebagai sasaran CAS12A. Dua pasang primer Mira direka masing -masing. Sistem CAS13A hanya mengiktiraf RNA, jadi rantau primer ke hadapan direka, yang mengandungi promoter T7 untuk transkripsi dan pengaktifan CAS13A berikutnya. PAM ditambah kepada gen NOS. Penambahan di atas memastikan bahawa kedua-dua protein CAS13A dan CAS12A boleh mengikat kepada cRRNA masing-masing, dan tidak ada gangguan atau tindak balas silang antara kedua-dua sistem.
Keadaan eksperimen
Kepekaan dan kekhususan
Sampel dicairkan dalam kecerunan untuk menguji intensiti pendarfluor reaksi Mira. Telah didapati bahawa intensiti pendarfluor masih dapat dikesan pada kepekatan sampel sebanyak 20 μL. Kepekatan 20 μL akhirnya dipilih untuk percubaan.
(Kepekatan sampel yang berbeza dan jalur ujian digunakan untuk pembangunan warna dan pengiraan kuantiti intensiti)
Untuk terus menilai kekhususan MR-DCA, pasukan penyelidikan menguji sampel campuran haiwan bukan transgenik dan tumbuhan bukan transgenik. Hasilnya menunjukkan bahawa hanya sampel transgenik yang mengandungi CAMV35S dan NOS mempunyai isyarat pendarfluor yang tinggi, sementara intensitas pendarfluor sampel lain adalah dekat dengan kawalan negatif. MR-DCA boleh digunakan sebagai platform pengesanan asid nukleik dwi-sasaran tertentu.
24 sampel tanaman diuji oleh MR-DCA. Antaranya, 1, 2, 15, 16, 21, dan 22 adalah jagung transgenik yang mengandungi promoter CAMV35S. 7, 8, 23, dan 24 adalah beras transgenik tahan penyakit yang mengandungi terminator NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17, dan 18 adalah kacang soya transgenik yang mengandungi promoter CAMV35S dan terminator NOS.
(Hasil ujian 24 sampel)
Tindak balas pesat
Masa tindak balas adalah faktor penting dalam pengesanan di tapak. Pasukan penyelidikan mendapati bahawa isyarat pendarfluor FAM dan HEX dapat dikesan oleh instrumen pendarfluor ketika waktu reaksi adalah 10 minit. MIRA digabungkan dengan tindak balas CRISPR juga mengamati pendarfluor kuning selepas 15 minit.
(Isyarat pendarfluor pada masa tindak balas MIRA yang berbeza)
(Perkembangan warna jalur ujian pada masa tindak balas Mira yang berbeza dan pengiraan kuantiti intensiti)
Kesimpulan eksperimen
Hasil eksperimen menunjukkan bahawa dwi MIRA mempunyai kekhususan yang baik dan dapat memperoleh produk penguatan CAMV35S dan NOS dengan tepat. Sistem CAS13A dan CAS12A bertindak balas secara bebas tanpa mengganggu satu sama lain. Ujian MR-DCA dapat mengesan 20 salinan dengan tepat pada suhu rendah 35 minit, yang mempunyai nilai yang besar dalam mengesan tanaman yang diubahsuai secara genetik di lapangan.
Maklumat artikel
Nama Jurnal: 《Journal of Advanced Research Express
Tajuk Artikel: 《Pembangunan ujian pengesan dwi dual cas13a/cas12a-mediated novel untuk tanaman yang diubah suai secara genetik Ekspres
Faktor kesan: 11.4
Pasukan Penyelidikan: Wang Xiaofu, Zhejiang Akademi Sains Pertanian