Artikel ini mencadangkan teknologi cip mikrofluid baru untuk pengesanan multiplex mikroorganisma patogen udang. Pasukan penyelidikan mengintegrasikan teknologi amplifikasi asid nukleik isothermal (MIRA) yang multi-enzim dan kaedah pengesanan pendarfluor masa nyata. Cip mikrofluid ini menyediakan penyelesaian yang cepat, sensitif dan cekap untuk pengesanan di tapak patogen udang utama.
Latar Belakang dan Kepentingan Penyelidikan
Industri pertanian udang global adalah salah satu komponen ekonomi yang paling penting dalam akuakultur, tetapi industri telah lama menghadapi ancaman dari pelbagai mikroorganisma patogen. Patogen ini sering membawa kepada kematian besar-besaran udang, serius mempengaruhi manfaat pengeluaran dan ekonomi. Termasuk penyakit nekrosis hepatopancreatic akut (AHPND), virus sindrom spot putih (WSSV), hipodermal dan hematopoietik virus nekrosis (IHHNV), udang hemocyte iridovirus (shIV)
Kaedah pengesanan patogen tradisional, seperti tindak balas rantai polimerase (teknologi PCR), mempunyai kepekaan dan kekhususan yang tinggi, tetapi adalah kompleks untuk beroperasi, mengambil masa yang lama, dan bergantung pada peralatan makmal. Keterbatasan ini menjadikan teknologi PCR tidak sesuai untuk ujian di tapak yang cepat. Teknologi MIRA telah menjadi alat pengesanan molekul yang sesuai untuk aplikasi di tapak kerana ciri-ciri penguatan pesatnya di bawah suhu malar dan suhu normal.
Prinsip Teknologi MIRA
Teknologi Penguatan Asid Nukleik Rapid Multi-Enzyme (MIRA Technology) adalah teknologi penguatan suhu tetap yang bergantung kepada sinergi pelbagai protein berfungsi pada suhu bilik untuk mencapai penguatan pesat asid nukleik. Ia adalah teknologi pengesanan asid nukleik pesat di tapak yang benar-benar mudah alih. Berbanding dengan PCR, MIRA mempunyai lebih banyak kelebihan.
Reka bentuk dan inovasi cip mikrofluid
Gambarajah skematik platform pengesanan RPA pada cip untuk beberapa mikroorganisma patogen udang penting
(A) Struktur cip mikrofluid jenis cakera. 1: ruang tindak balas; 2: injap bola; 3: pelabuhan ekzos; 4: pelabuhan pensampelan;
(B) Pandangan meletup. 5: filem pengedap haba; 6: Substrat cip.
(C) Susun atur terperinci enam set primer dalam sektor ini. Setiap set primer adalah pra-tetap dalam ruang tindak balas yang ditetapkan.
(D) Prosedur operasi lengkap pada platform pengesanan RPA cip.
Artikel ini mencadangkan cip mikrofluid yang disepadukan dengan teknologi MIRA untuk pengesanan multiplex mikroorganisma patogen udang. Teknologi mikrofluidik dapat mengawal cecair dalam saluran peringkat mikron untuk manipulasi yang tepat, dengan itu mencapai pengesanan multi-sasaran yang cekap dan murah.
Cip mempunyai ciri reka bentuk utama berikut:
● Cip microfluidic centrifugal
Cip mengamalkan reka bentuk pemacu empar, menggunakan daya sentrifugal untuk secara merata mengedarkan sampel ke dalam setiap ruang tindak balas. Reka bentuk ini memudahkan proses operasi, dan pengendali dapat menyelesaikan keseluruhan tindak balas dengan hanya menyuntik sampel.
● Pengesanan pelbagai sasaran
Cip itu terlebih dahulu dengan jenis bakteria yang perlu dikesan: nekrosis hepatopancreatic akut (V-AHPND), virus sindrom spot putih (WSSV), virus nekrosis subkutaneus (shiv) (shiv), shiv), shivs), hemositus), hemositus) ) Probe primer untuk lima patogen. Reka bentuk ini secara serentak dapat mengesan enam sasaran gen dalam satu tindak balas, membolehkan pemeriksaan pesat pelbagai patogen.
● Pengesanan pendarfluor masa nyata
Reaksi penguatan teknologi MIRA dalam cip digabungkan dengan siasatan pendarfluor, yang dapat memantau kemajuan reaksi penguatan dalam masa nyata. Reka bentuk siasatan membolehkan isyarat pendarfluor hanya dikeluarkan apabila produk amplifikasi dihasilkan, dengan itu mencapai pengesanan kuantitatif yang cepat dan sensitif.
● Sistem tindak balas kepekatan yang rendah
Setiap unit tindak balas cip hanya memerlukan jumlah tindak balas 5 μl, yang sangat mengurangkan penggunaan reagen. Apabila keseluruhan sistem berjalan, sehingga empat sampel dapat diproses serentak, dan setiap sampel dapat mengesan lima patogen, meningkatkan kecekapan pengesanan.
Kepekaan, kekhususan dan kebolehulangan
Prestasi sistem cip termasuk pengesanan simetri, resonans dan kebolehulangan.
● Kepekaan
Hasil eksperimen menunjukkan bahawa cip dapat mengesan nombor salinan gen sasaran serendah 10 salinan/μL, dengan kepekaan yang setanding atau lebih tinggi daripada kaedah PCR tradisional. Kepekaan yang tinggi ini memastikan bahawa teknologi dapat mengesan individu yang dijangkiti awal dalam aplikasi praktikal, dengan itu membolehkan pemeriksaan awal patogen.
● Kekhususan
Eksperimen ini menjalankan ujian silang tindak balas pada pelbagai patogen bukan sasaran, dan hasilnya menunjukkan bahawa cip itu sangat spesifik untuk patogen sasaran dan dapat membezakan dengan tepat pelbagai jenis patogen. Semua ujian untuk penyakit nekrosis hepatopancreatic akut (V-AHPND), virus sindrom spot putih (WSSV), hipodermal dan hematopoietik nekrosis virus (shiv) Kaedah secara berkesan boleh mengelakkan penguatan tidak spesifik.
● Kebolehulangan
Untuk menilai kestabilan kaedah, pasukan penyelidikan menjalankan pelbagai eksperimen berulang. Keputusan menunjukkan bahawa pekali variasi (nilai CV) antara eksperimen yang berbeza adalah kurang daripada 10%, menunjukkan kebolehulangan dan konsistensi eksperimen yang baik.
Aplikasi dan kelebihan lapangan
Reka bentuk cip mikrofluid Teknologi MIRA memberikan kelebihan aplikasi medan yang signifikan, terutama yang sesuai untuk pengesanan dan pemantauan patogen pesat dalam pertanian udang:
● Proses operasi yang mudah
Keseluruhan proses pengesanan hanya memerlukan menyuntik sampel ke dalam cip dan memulakan peranti reaksi. Ia memerlukan hampir tiada operasi manual dan sesuai untuk bukan profesional untuk digunakan di tapak.
● Keupayaan tindak balas cepat
Sistem ini boleh mendapatkan keputusan ujian dalam masa 20 minit, sangat memendekkan masa ujian. Ini penting untuk tindak balas penyakit pesat di ladang dan mengurangkan penyebaran patogen.
● Keupayaan pengesanan multiplex
Lima patogen utama boleh dikenalpasti dalam satu ujian, yang meningkatkan kecekapan pengesanan dan menjimatkan kos dan masa pengesanan.
Prospek Teknologi MIRA
Walaupun teknologi PCR telah lama dinilai sebagai standard emas untuk pengesanan amplifikasi asid nukleik, teknologi MIRA telah menunjukkan potensi aplikasi yang hebat kerana tindak balasnya yang cepat pada suhu malar, operasi mudah, dan keperluan peralatan yang rendah. Dengan membandingkan dengan PCR yang digabungkan dengan penjujukan DNA, didapati bahawa keputusan pengesanan cip penguatan isoterma adalah konsisten dengan hasil PCR dari segi kepekaan dan kekhususan, dan masa reaksi teknologi MIRA dipendekkan dengan ketara. Oleh itu, cip mikrofluidik teknologi MIRA dianggap sebagai teknologi yang lebih sesuai untuk aplikasi lapangan, terutamanya dalam persekitaran yang memerlukan pengesanan patogen pesat dan besar.
Cip mikrofluidik berdasarkan teknologi penguatan asid nukleik pesat isothermal (MIRA) pelbagai enzim menyediakan alat yang berkesan untuk mengesan mikroorganisma patogen dalam pertanian udang. Teknologi ini mempunyai kelebihan kepekaan yang tinggi, kekhususan yang baik, operasi mudah, dan kelajuan pengesanan yang cepat, dan mempunyai prospek aplikasi yang luas dalam pencegahan dan kawalan penyakit akuakultur. Dengan perkembangan dan pengoptimuman teknologi selanjutnya, sistem ini dijangka akan digunakan untuk mengesan patogen lebih banyak akuatik, yang membolehkan pencegahan dan pemantauan penyakit yang lebih luas.
Hasil penyelidikan menyediakan kaedah pengesanan awal yang boleh dipercayai untuk industri akuakultur, yang dapat mengurangkan risiko wabak penyakit, meningkatkan kecekapan pengeluaran dan output ladang, dan meletakkan asas teknikal untuk pembangunan mampan industri akuakultur.