Perkongsian Artikel丨Satu AI-platform mikrofluidik CRISPR-Cas14a yang dipertingkat untuk tepat pada-pengesanan tapak geminivirus dalam tumbuhan tomato dan lalat putih

Geminivirus menimbulkan ancaman teruk kepada pengeluaran tomato global melalui evolusi pesat dan penghantaran whiteflymediated di seluruh dunia. Kaedah pengesanan semasa menyasarkan terutamanya tumbuhan bergejala, selalunya memberikan hasil diagnostik hanya selepas viral load telah mencapai tahap yang boleh ditularkan, menyebabkan kawalan penyakit tidak berkesan. Intervensi awal bergantung pada mengenal pasti jangkitan sebelum permulaan simptom-atau pun mengesan kehadiran virus dalam vektor serangga sebelum ia menghantar virus kepada tumbuhan. Walaupun kemajuan terkini dalam amplifikasi isoterma dan diagnostik berasaskan CRISPR-menawarkan penyelesaian yang berpotensi, pelaksanaan praktikal menghadapi had yang wujud: ketidakserasian antara sistem amplifikasi enzimatik dan CRISPR, risiko pencemaran daripada prosedur berbilang langkah dan kebolehsesuaian medan peranti pengesanan yang tidak mencukupi. Untuk menangani cabaran ini, kami membangunkan MaC14a-platform mikrobendalir dipertingkatkan-AI yang menyepadukan penguatan pantas isoterma multienzim asimetri (aMIRA) dengan CRISPR-Cas14a. Sistem ini mengatasi halangan teknikal utama dengan mengoptimumkan stoikiometri primer untuk menjana ssDNA untuk{12}}pengaktifan Cas14a bebas PAM, mencapai pengesanan ultrasensitif (10 fM) sambil menghapuskan{15}}pencemaran silang melalui{16}}tindak balas tiub tunggal. Digandingkan dengan cip mikrobendalir emparan, pengesanan optik mudah alih dan tafsiran isyarat berasaskan pembelajaran mesin{18}}, MaC14a mendayakan pengesanan berganda bagi empat geminivirus dalam masa 5 minit, menunjukkan ketepatan diagnostik 100% untuk kedua-dua sampel tumbuhan dan lalat putih. Penemuannya termasuk: (i) pengesanan jangkitan prasimptomatik dalam tumbuhan, dan (ii) penentuan tepat pengangkutan virus dalam lalat putih individu-mengisi jurang teknologi kritikal dalam-pengawasan sebelum penghantaran. Selain menyediakan alat baharu untuk pengurusan geminivirus, kajian ini mewujudkan paradigma "AI-CRISPR-mikrofluidik" untuk perlindungan tanaman. Dengan mengalihkan tumpuan daripada tumbuhan bergejala kepada vektor viruliferous dan jangkitan tanpa gejala, teknologi ini menawarkan penyelesaian transformatif untuk mengganggu kitaran penghantaran virus di sumbernya.

Aliran kerja bersepadu sistem MaC14a untuk pengawasan geminivirus multipleks.

(A) Mekanisme pengesanan asid nukleik pengantara aMIRA-Cas14a-. Skema menggambarkan penguatan ssDNA dipacu aMIRA-digandingkan dengan pengecaman ssDNA bebas PAM Cas14a dan aktiviti belahan cagaran, membolehkan pengesanan tiub-tunggal (serasi dengan instrumen PCR pendarfluor masa-sebenar) atau pada{-}analisis pengesanan mikrofluor tersuai peranti). (B) Aliran kerja pengesanan mikrobendalir (MaC14a) untuk diagnostik{12}}bidang yang boleh digunakan. Langkah masa ditunjukkan dengan anak panah, menunjukkan tempoh setiap proses dalam penganalisis mudah alih. (C) Carta Aliran algoritma pengesanan masa-sebenar berdasarkan rangkaian Memori Jangka-Panjang Pendek (LSTM). Algoritma yang dioptimumkan memudahkan{18}}pemprosesan masa sebenar isyarat pendarfluor, membolehkan tafsiran hasil dalam masa 5–10 min.

Sistem pengesanan aMIRA-Cas14a

(A) Gambarajah skematik menggambarkan mekanisme tindak balas aMIRA-platform pengesanan Cas14a. (B) Aktiviti belahan khusus Cas14a pada produk aMIRA telah disahkan melalui analisis elektroforesis gel (C) Analisis perbandingan satu-langkah dan dua-langkah aMIRA-kaedah pengesanan Cas14a. Nota: Dalam protokol tindak balas dua-langkah, proses bermula dengan penguatan aMIR selama 20{{16}minit, diikuti dengan penambahan sistem pengesanan Cas14a untuk pemantauan pendarfluor. Akibatnya, pengumpulan isyarat pendarfluor bermula pada titik masa 20 minit. (D) dan (E) Eksperimen pengoptimuman telah dijalankan untuk menentukan nisbah primer ke hadapan dan songsang yang optimum. (F-I) Kekhususan sistem aMIRA-Cas14a telah disahkan melalui pengesanan empat sasaran virus yang berbeza (TYLCCNV, TYLCV, TOLCNDV, dan TbCSV) dalam sampel tumbuhan. Sampel campuran (ditetapkan sebagai Campuran) disediakan dengan menggabungkan jumlah yang sama bagi setiap penyediaan DNA virus.

Untuk mencapai penguatan isyarat bagi jumlah surih asid nukleik virus dan menyediakan substrat yang mencukupi untuk Cas14a, kami membangunkan aMIRA (penguatan pantas isoterma multienzim asimetri) berdasarkan MIRA. Sistem aMIRA-Cas14a yang terhasil menawarkan kelebihan utama berikut:

1. Stoikiometri primer yang dioptimumkan membolehkan MIRA lebih suka mengeluarkan ssDNA, yang berfungsi sebagai substrat langsung untuk Cas14a. Dengan melaraskan nisbah primer-ke-terbalikkan kepada 20:1, sistem menjana ssDNA yang mencukupi untuk mengaktifkan-aktiviti belahan bebas PAM Cas14a, yang secara khusus mengecam dan memotong ssDNA.
2. Penyepaduan satu periuk MIRA dan CRISPR-Cas14a menghapuskan risiko pencemaran silang.
3. MIRA meningkatkan sensitiviti pengesanan dengan ketara, membolehkan pengesanan asid nukleik virus yang sangat rendah.
4. aMIRA-Cas14a mengekalkan kekhususan yang tinggi, mengelakkan positif palsu yang disebabkan oleh penguatan bukan khusus.

Akhirnya, penyepaduan satu periuk MIRA dan CRISPR-Cas14a menghapuskan risiko pencemaran dan mencapai sinergi yang sempurna antara kekuatan MIRA dan sistem CRISPR-Cas14a. Ini menyelesaikan cabaran ketidakserasian seluruh industri antara penguatan isoterma dan sistem CRISPR, yang mewakili kejayaan teknologi teras platform MaC14a. Sistem aMIRA-Cas14a mencapai peningkatan 1,000 kali ganda dalam sensitiviti sambil memastikan penguatan khusus. Digabungkan dengan pengecaman khusus jujukan bagi Cas14a, ini menyediakan pengesahan kekhususan dwi-lapisan, tanpa kereaktifan silang terhadap virus bukan sasaran atau sampel sihat-yang menangani satu lagi titik kesakitan industri: kecenderungan untuk positif palsu.

Reagen penguatan pantas isoterma multienzim MIRA yang digunakan dalam kajian ini disediakan oleh Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Di luar prestasi reagen yang cemerlang, Amp‑future Biotech juga menawarkan pasukan sokongan teknikal yang profesional dan responsif pantas.

MIRA menunjukkan keserasian yang kukuh dengan cip mikrofluidik berasaskan centrifuge-yang dibangunkan untuk aplikasi penyelidikan dan diagnostik:

1.Sistem tindak balas yang dikecilkan, sesuai untuk mikro-ruang tindak balas volum ciri cip mikrobendalir;
2. Keupayaan pengesanan berbilang dalam satu larian;
3. Keserasian dengan peranti mudah alih, aliran kerja yang lancar daripada sampel kepada hasil.

Penganalisis mudah alih dan seni bina cip.

(A) Pandangan meletup bagi peranti pengesan mudah alih, menunjukkan komponen utama. (B) Seni bina modular cip mikrofluidik emparan. (C) Kawalan bendalir yang dipacu oleh sentrifugasi. Analisis trajektori pengangkutan cecair di bawah daya emparan boleh atur cara.

kami merekayasa peranti mudah alih "sampel-masuk, jawab-keluar"-bagi-peranti ujian penjagaan (POCT) yang dioptimumkan untuk penggunaan medan, seperti yang digambarkan dalam Rajah. 4A. Prototaip padat (23 cm (L) × 21 cm (W) × 14 cm (H), jumlah jisim 12.5 kg) mencapai kemudahalihan yang luar biasa. Komponen teras sistem termasuk motor servo -kepersisan tinggi untuk kawalan putaran yang tepat dan unit pemanasan udara untuk pengawalan suhu. Modul pengesanan optik bersepadu, diletakkan di bawah cip, memudahkan pengujaan dan pengukuran pendarfluor, memastikan sensitiviti dan ketepatan yang tinggi dalam pengesanan. Peranti mudah alih ini dilengkapi dengan sistem pengendalian Android terbenam, menawarkan antara muka{14}mesra pengguna di mana pengendali boleh memilih fail operasi praprogram yang mengandungi parameter terperinci seperti masa tindak balas dan suhu. Keputusan dan kesimpulan dipaparkan dalam masa-sebenar pada skrin LCD, membolehkan pemerolehan maklumat pantas. Selain itu, sistem ini menggabungkan modul komunikasi wayarles yang menyokong-masa sebenar penghantaran data ke peranti mudah alih atau pelayan awan, menyepadukan dengan algoritma kecerdasan buatan untuk tafsiran serta-merta dan analisis keputusan ujian.

news-800-847

Untuk menilai kapasiti sistem MaC14a untuk mengesan viruscarriage dalam vektor serangga, kami menjalankan ujian pemerolehan TYLCV menggunakan

Populasi Bemisia tabaci. Whiteflies dibenarkan tempoh makan pemerolehan 3-hari pada tumbuhan yang dijangkiti TYLCV dan kemudian diproses melalui

Sistem MaC14a (Gamb. D). Analisis seterusnya mendedahkan bahawa 8 daripada 10 lalat putih yang diuji (80%) mempamerkan isyarat virus positif (Gamb. E). Yang penting, semua spesimen daripada kohort kawalan negatif (diberikan secara eksklusif pada tumbuhan yang sihat) mengekalkan tahap pendarfluor garis dasar. Keputusan ini menunjukkan bahawa sistem MaC14a boleh mengenal pasti dengan tepat virus-}yang mengawal virusnya pada tahap virus yang berpotensi. penghantaran dalam persekitaran pertanian.

Dalam eksperimen pengesahan buta-berganda seterusnya, kami menguji 20 sampel daun tomato (S1–S20) yang dikumpulkan daripada dua zon penanaman rumah hijau di Hangzhou, Wilayah Zhejiang, China dan dua rumah hijauzon penanaman di Nanning, Wilayah Guangxi, China. Setiap zonmenyediakan lima sampel daun tomato yang menunjukkan simptom tipikal virusjangkitan (seperti klorosis, bintik-bintik mozek dan keriting daun) dan limalalat putih (20 kesemuanya). Sistem MaC14a yang dipertingkatkan AI-menghantar semulasults pada minit ke-5, yang konsisten sepenuhnya dengan yang diperolehdaripada 60-minit ujian aMIRA-Cas14a dan platform qPCR, menunjukkan100 % persetujuan (Gamb. F, S6-S7, Jadual S3). Selain itu, virusspesies yang dikesan dalam sampel tumbuhan adalah sangat konsisten dengan merekadikenal pasti dalam serangga vektor dari zon penanaman yang sama. Inikeputusan menyerlahkan potensi ketara AI-MaC14a dipertingkatkan pada-diagnostik virus tumbuhan tapak, mencapai kelajuan tinggi (daripada asid nukleikpengekstrakan untuk menghasilkan bacaan dalam hanya 10 min), ketepatan tinggi (konsistendengan keputusan qPCR), dan mudah alih.

Perkongsian Artikel丨Satu AI-CRISPR yang dipertingkatkan-Platform Mikrobendalir Cas14a Untuk Pengesanan Tepat di-tapak Virus Gemini dalam Tumbuhan Tomato dan Lalat Putih