Udang rumput adalah spesies ekonomi yang penting dalam industri akuakultur air tawar China. Walau bagaimanapun, dalam beberapa tahun kebelakangan ini,Hepatopankreas mikrosporidium(EHP), parasit yang menjangkiti hepatopancreas udang, telah memberi kesan besar kepada industri. Memandangkan pada masa ini tiada ubat atau vaksin yang berkesan untuk merawat penyakit ini, pengesanan yang cepat dan tepat adalah penting untuk mengelakkan penyebarannya.
A.Magnified 9. 0 × 1 0 3 kali; B. diperbesarkan 5.0 × 104 kali.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang Ge, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Pengasingan dan pemerhatian morfologi microsporidium hepatopancreatic di Litopenaeus vannamei. Jurnal Sains Perikanan China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.J.1118.2018.17430.
Pengesanan EHP terutamanya bergantung kepada kaedah biologi molekul, dengan teknologi PCR menjadi yang paling biasa. Walau bagaimanapun, sementara PCR menawarkan kepekaan yang tinggi, ia memerlukan peralatan PCR yang mahal dan persekitaran makmal khusus, menjadikannya tidak sesuai untuk kegunaan lapangan. Untuk menangani isu ini, pasukan penyelidikan membangunkan dua kaedah pengesanan pesat berdasarkan teknologi MIRA. Kaedah ini menawarkan kepekaan yang tinggi, tindak balas cepat, dan operasi yang mudah, membolehkan pengesanan EHP yang cekap dan pesat di udang di tempat tanpa memerlukan peralatan makmal yang kompleks, dengan itu mengisi jurang dalam kaedah pengesanan semasa.
Reagen amplifikasi yang digunakan dalam kajian ini:
- Kit Penguatan Rapid Isothermal DNA (Asas)
- Kit Penguatan Rapid Isothermal DNA (jenis jalur emas koloid)
Teknologi MIRA adalah kaedah amplifikasi asid nukleik isothermal pelbagai enzim. Prinsip terasnya melibatkan tindakan yang diselaraskan dari pelbagai protein berfungsi pada suhu ambien untuk mencapai penguatan asid nukleik yang cepat, yang membolehkan pengesanan asid nukleik di lokasi yang benar-benar mudah alih.
Kaedah penyelidikan
Pengekstrakan sampel
Pasukan penyelidikan mengumpul sampel udang rumput yang dijangkiti dan sihat dari tiga ladang udang di wilayah Liaoning, mengeluarkan DNA dari hepatopancreas udang.
Reka bentuk primer
Tiga set primer Mira direka untuk mensasarkan gen protein serine S8 EHP (nombor penyertaan GenBank: pada tahun 182063). Gen ini mempunyai tapak aktif yang unik, memastikan kekhususan pengesanan.
Pengesanan Mira-Age dan Mira-LFD
(A) Suhu tindak balas RPA-AGE yang dioptimumkan. M: DL 500 penanda; N: kawalan negatif; Strain 1-5: 25 darjah, 30 darjah, 37 darjah, 39 darjah, dan 42 darjah.
(B) mengoptimumkan masa reaksi RPA-usia. M: DL 500 penanda; N: kawalan negatif; 1: 10 min; 2: 20 min; 3: 30 min; 4: 40 min.
(C) mengoptimumkan suhu tindak balas RPA-LFD. N: kawalan negatif; 1: 25 darjah; 2: 30 darjah; 3: 37 darjah; 4: 39 darjah; 5: 42 darjah.
(D) Mengoptimumkan masa tindak balas RPA-LFD. N: kawalan negatif; 1: 5 min; 2: 10 min; 3: 20 min.
Kedua-dua kaedah pengesanan MIRA, MIRA-AGE (Agarose Gel Electrophoresis) dan MIRA-LFD (Immunoassay Aliran Lateral Colloidal Gold), digunakan untuk mengesan EHP. Pasukan penyelidikan mengoptimumkan suhu tindak balas dan masa melalui percubaan. MIRA-AGE menguatkan DNA sasaran dalam 30 minit pada 37 darjah, manakala MIRA-LFD menyelesaikan penguatan dalam hanya 10 minit pada 37 darjah, dengan keputusan boleh dibaca dalam masa 5 minit.
Hasil eksperimen
Kekhususan dan kepekaan
(A) Kekhususan pengesanan RPA-AGE. M: DL 1000 penanda; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: White Spot Syndrome Virus; 6: Abnormal; N: Kawalan negatif.
(B) Kekhususan pengesanan RPA-LFD. P: Nosema Bombycis; N: kawalan negatif; 1: EHP; 2: encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: White Spot Syndrome Virus; 6: Abnormal.
(C) Kepekaan RPA-AGE dengan pencairan kecerunan plasmid rekombinan. M: DL 500 penanda; N: kawalan negatif; 1: 4.7 × 10^5 salinan/μl; 2: 4.7 × 10^4 salinan/μl; 3: 4.7 × 10^3 salinan/μl; 4: 4.7 × 10^2 salinan/μl; 5: 4.7 salinan/μl; 6: 4.7 salinan/μl.
(D) Kepekaan RPA-LFD dengan pencairan kecerunan plasmid rekombinan. N: kawalan negatif; 1: 4.7 × 10^5 salinan/μl; 2: 4.7 × 10^4 salinan/μl; 3: 4.7 × 10^3 salinan/μl; 4: 4.7 × 10^2 salinan/μl; 5: 4.7 salinan/μl; dan 6: 4.7 salinan/μl.
Eksperimen menunjukkan bahawa teknologi MIRA mempunyai kekhususan yang tinggi, dengan tepat mengesan EHP tanpa bertindak balas terhadap patogen lain. Dari segi kepekaan, kedua -dua kaedah mempunyai had pengesanan 4.7 salinan/μL, jauh lebih tinggi daripada kepekaan PCR tradisional.
Ujian sampel klinikal
Hasil daripada menguji 30 sampel klinikal menunjukkan bahawa MIRA-AGE dan MIRA-LFD mempunyai kadar positif sebanyak 70%, sedikit lebih rendah daripada 80%QPCR tetapi jauh lebih tinggi daripada 56.7%PCR tradisional.
Prospek permohonan
Kaedah pengesanan berasaskan MIRA membolehkan penguatan cepat gen sasaran pada suhu yang berterusan. Khususnya, kaedah MIRA-LFD boleh menyampaikan hasil dalam hanya 10 minit tanpa memerlukan peralatan makmal yang kompleks, menjadikannya sesuai untuk kegunaan di lokasi di ladang udang. Kepekaan dan kekhususan teknologi ini menjadikannya alat yang cekap untuk pengesanan dan kawalan awal EHP, dengan itu melindungi kesihatan dan pembangunan industri pertanian udang rumput.
Antara kaedah ini, immunoassay aliran emas koloid (MIRA-LFD) sangat sesuai untuk aplikasi di tapak kerana kesederhanaan dan hasil intuitifnya. Petani udang rumput dapat mengesan dan bertindak balas terhadap jangkitan EHP dengan cepat, meningkatkan keupayaan kawalan penyakit, meningkatkan kecekapan pertanian, dan mengurangkan kerugian ekonomi.